FELUDA : A FIRST CRISPR - Cas BASED RAPID DIAGNOSIS KIT WITH LOW COST AND HIGHER EFFICACY MADE IN CSIR - IGIB , DELHI INDIA.

 ? WHAT A CRISPR - Cas SYSTEM IS :

CRISPR - Cas  is  a  genome  editing  tool  that  is  creating  a  buzz  in  the  genome  editing  world  of  genetics  and  biotechnology. It  is  faster , cheaper  and  more  accurate  than  the  previous  techniques  of  editing  genome  and  has  a  wide  range  of  potential  applications. It  is  a  natural  genome  editing  system  found  in  bacteria  as  a  defence  mechanism  against  viruses  because  when  a  virus  infects  a  bacteria  it  inject  its  genome  inside  the  bacteria  and  there  the  genome  of  virus  gets  integrated  with  bacterial  genome  which  leads  to  hijacking  of  bacterial  replication  machinery  by  virus , allowing  virus  to  produce  progeny  viruses  which  leads  to  death  of  bacterial  cell. Bacteria  by using  CRISPR  snips  out  parts  of  virus  genome  and  keep  a  bit  of  it  behind  to  help  them  recognise  and  defend  against  the  virus  next  time  it  attack. CRISPR  stands  for  the  Clustered  Regularly  Interspaced  Short  Palindromic  Repeats  where  as  Cas  stands  for  the  CRISPR  associated  proteins. The  CRISPR - Cas  system  consists  of  two  key  molecules  that  introduce  a  change  into  the  genome.

1. Cas Enzyme : Cas  is  an  endonuclease  enzyme ( molecular  scissors )  that  can  cut  the  two  strands  of  DNA  at  a  specific  location  in  the  genome  so  that  bits  of  genome  can  than  be  added  or  removed. Cas  follows  the  guide  RNA  to  the  target  site  in  the  genome  where  it  makes  a  cut  across  both  strands  of  the  DNA. 

    

2. Guide RNA : Guide  RNA  consists  of  a  small  piece  of  pre - designed  RNA  sequence  of  about  20  bases  long  located  within  a  longer  RNA  scaffold  which  are  complementary  to  the  target  site  of  genome. The  scaffold  part  binds  to  the  genome  and  the  pre - designed  sequence  guides  Cas  to  the  right  part  of  the  genome. This  makes  sure  that  the Cas  enzyme  cuts  at  the  right  points  in  the  genome.

#  CRISPR  sequences  were  first  discovered  in  bacteria  Escherichia .coli  by  researcher "Yoshizumi  Ishino"  and  his  colleagues  in  1987. But  CRISPR - Cas  as  a  genome  editing  tool  was  first  proposed  by " Doudna "  and " Emmanuelle  Charpentier " in  2012.

FELUDA TEST KIT :

Senior  scientists  Dr.  Debojyoti  Chakraborty  and  Dr.  Souvik  Maiti  at  CSIR - IGIB , Delhi  for  the  first  time  invented  a  CRISPR - Cas  based  rapid  diagnosis  kit  for  covid  infection  detection  named  as  " FELUDA " ( FnCas9  Editor  Linked  Uniform  Detection  Assay ). Feluda  is  a  paper  strip  based  diagnosis  kit  that  works  by  combining  CRISPR  system  and  paper  strip  Chemistry. The  paper  based  diagnosis  test  is  similar  to  mechanism  of  a  pregnancy  test  kit  where  we  dip  the  paper  strip  in  the  solution  and  colour  changes. The  strip  consist  of  two  lines :

• Control  line  which  is  present  in  the  every  strip  that  is  being  used  and  indicates  that  the  strip  is  working  proper.
• Test  line  which  comes  positive  (coloured ) when  there  is  suspected  agent  of  the  covid  infection  in  the  sample  and  vice - versa.

COST OF KIT : 500  rupees  for  a  single  kit  which  is  more  cheaper  than  the  RT - PCR  test  which  cost  around  4,500  rupees.

TIME REQUIRED : less  than  one  hour  around  30  minutes  where  on  the  other  hand  RT - PCR  takes  4 to 6  hours  for  single  sample.

EFFICACY : Have  excellent  efficacy  as  that  of  RT - PCR.

TESTS THAT ARE BEING USED TO DIAGNOSE THE COVID - 19 INFECTION , THEIR COST AND EFFICACY.

Diagnosis  of  covid - 19  infection  may  be  broadly  divided  into  two  categories  that  are  now  a  days  used  world  wide.

• Molecular  Tests :  collections  of  techniques  used  to  analyse  biological  markers  in  the  genome  and  proteome - the  individuals  genetic  code  and  how  their  cells  expresses  their  genes  as  proteins. Real  Time  Reverse  Transcription  PCR  is  the  one  such  molecular  test  that  is  used  to  diagnose  the  covid - 19  infection.

• Serological  Tests :  tests  usually  refers  to  the  diagnosis  identification  of  antibodies  in  the  serum  and  these  antibodies  are  typically  formed  in  the  response  to  an  infection , against  others  foreign  proteins , or  to  own  bodies  proteins. Rapid  Diagnosis  Test ( RDT )  Kits  are  used  to  diagnose  the  covid - 19  infection.

REAL TIME REVERSE TRANSCRIPTION PCR TEST : 

It  is  known  as  RT - PCR  because  this  PCR  uses  an  enzyme  called  as  Reverse  Transcriptase  that  carries  out  Reverse  Transcription  by  converting  RNA  into  DNA  which  is  just  reverse  of  Transcription  and  that  is  the  principle  over  which  the  diagnosis  of  covid - 19  infection  via  RT - PCR  is  based  on. This  RT - PCR  can  be  run  into  real  time  for  Quantification  of  PCR  product  that  why  its  together  known  as  Real  Time  RT - PCR.

• Specimen  is  first  collected  from  infected  patients  which  includes  Nasopharyngeal , Oropharyngeal  Swab , Sputum , Broncoalveolar  lavage  and  Faeces  too. After  collection  of  specimen  Lysis  Buffer  is  added  in  the  specimen  containing  virus  in  order  to  extract  the  viral  RNA  as  the  subjective  pathogen  is  a  ss - RNA  virus.
• RNA  is  than  purified  from  specimen  using  a  Spin  which  contains  stationary  Silica  matrix , so  when  sample  is  allowed  to  pass  through  the  spin  column  RNA  molecules  gets  attached  to  the  silica  matrix. After  that  Elution  Buffer  is  added  to  spin  column  in  order  to  remove  the  RNA  from  silica  matrix  to  further  proceed  the  diagnosis  process  ahead.
• Separated  free  RNA  molecules  are  than  added  to  the  Master  Buffer  that  contains  Reverse  Transcriptase , DNA  Polymerase , Primers , dNTPs , and  TaqMan  probe  which  contains    quencher  and  reporter  dye  attached  to  it , this  is  followed  by  loading  the  reaction  mixture  in  the  PCR  plate  which  is  than  placed  in  the  PCR  Thermocycler  machine.
• This  allows  the  amplification  of  the  desired  target  sites  for  which  we  are  looking  in  like  RdRp  gene , E  gene , N  gene  in  case  of  Coronavirus , which  is  done  by  first  Reverse  Transcription  by  recruitment  of  Reverse  Transcriptase  resulting  in  the  DNA  strand  synthesis  complementary  to  RNA  strand.
• RNA - DNA  hybrid  is  denatured  which  is  the  initial  step  of  PCR  and  carried  out  at  95  degree  celsius  followed  by  annealing  which  includes  attachment  of  primer  at  3  prime  end  of  the  DNA  and  carried  out  at  58  degree  celsius , DNA  polymerase  is  than  recruited  on  the  DNA - Primer  junction  to  extend  primer  in  order  to  synthesized  ds - DNA  and  is  the  last  step  of  the  PCR  which  is  Extension.
• In  the  next  PCR  cycle  this  ds - DNA  is  than  denatured  followed  by  attachment  of  forward  and  backward  primers  on  the  different  strands  of  the  denatured  DNA , on  the  other  TaqMan  probe  binds  to  target  site  simultaneously  and  when  DNA  polymerase  reaches  to  TaqMan  probe  it  results  in  separation  of  reporter  from  quencher  and  reporter  dye  emits  fluorescence  indicating  presence  of  SARS - CoV - 2.

COST OF TEST :   Around  4,500  rupees  for  single  test.

TIME TAKEN :  4 - 6  hours.

EFFICACY :  Most  accurate  for  covid - 19  infection  and  has  excellent  efficacy.

RAPID DIAGNOSIS TEST KITS :

The  covid - 19  Rapid  Diagnosis  Test  kit  is  a  Qualitative  Lateral  Flow  Immunoassay  for  the  simultaneous  detection  of  IgM  and  IgG  antibodies  to  SARS - CoV - 2  in  the  whole  blood , serum or  plasma.

• The  test  cassette  contains  recombinant  SARS - CoV - 2  antigen  conjugated  to  coloured  particles. when  a  specimen  is  added  to  the  sample  well  of  the  cassette , any  IgM  and  IgG  present  in  the  specimen  will  bind  to  the  antigen  conjugate , forming  coloured  coronavirus  antigen - antibody  complexes. This  mixture  migrates  laterally  along  the  membrane  to  the  test  region. In  this  test  region , anti - human  IgG  have  been  immobilised  onto  the  membrane. These  capture  any  IgM  and  IgG  complexes  that  have  formed , resulting  in  the  appearance  of  coloured  lines.
• Therefore  if  the  specimen  contains  SARS - CoV - 2  IgM  antibodies , a  coloured  line  will  appear  in  the  IgM  test  line  region. If  the  specimen  contains  SARS - CoV- 2  IgG  antibodies , a  coloured  line  will  appear  in  the  IgG  test  region. 
• To  serve  as  an  internal  control , a  coloured  line  will  always  appear  in  the  control  line  region , indicating  that  the  proper  volume  of  specimen  and  buffer  has  been  added , and  correct  procedure  has  been  followed.

COST OF KIT :  450  as  per  ICMR  guideline.

TIME TAKEN :  10 - 15  minutes.

EFFICACY :  34 % - 80 %  efficacy  and  specific  IgM  antibodies  to  SARS - CoV - 2  become  detectable  in  3 - 5 days  after  onset  of  symptoms. On  the  other  hands  the  covid  testing  via  real  time  RT - PCR  can  be  done  from  the  day  of  symptoms  appear.

HOW COVID - 19 INFECTION RESEMBLES PNEUMONIA AND HOW ITS ULTIMATELY LEADS TO DEATH OF THE COVID PATIENT.

TARGET OF SARS - CoV - 2 : 

SARS - CoV -  2  mainly  found  to bind  on  the  Angiotensin  Converting  Enzyme - 2  (ACE - 2 ) receptor  which  are  being  expressed  on  Type - 2  Pneumocytes  of  Alveoli  in  lungs.  Alveoli  is composed  of  two  types  of  cells -

• Type - 1  Pneumocytes - Involve  in  gas  exchange.
• Type - 2  Pneumocytes - Produce  surfactants  that  maintains  alveolar  surface  tension. 

  The virus  binds  to  ACE - 2  receptor  by  means  of   S - spike  Glycoprotein  and  enters  inside  alveoli  where  it  starts  replicating  by  hijacking  the  host  replicating  machinery  and  forms  progeny  viruses  which  results  in  damage  of   Type - 2  Pneumocytes  which  in  turn  triggers  the  release  of  Pro -  inflammatory   Cytokines  ( leading  to  Cytokine  Storm )   such  as  IL - 6 , IL - 7 , IL - 10 , G - CSF , IP - 10  which  activates  Alveolar   Macrophages  which  on  activation  releases  cytokines  IL - 1 , IL - 6   and  TNF  which  causes  capillary  smooth  muscle  relaxation , endothelial  cell  contraction  and  retraction  causing  Vasodilation  and  increase  in  Capillary  Permeability  around  alveoli  as  a  result  of  this  Plasma  spills  out  into  the  interstitial  spaces  and  fluid  starts  accumulating  around  alveoli  and  compresses  alveoli.  Some  fluid  start  entering  and  accumulating  inside  alveoli  leading  to  a  condition  known  as  Acute  Respiratory  Distress  Syndrome  ( ARDS ) /  Wet  Lung  like  pneumonia  and  wash  out  surfactants  causing  further  damage  to  Type - 2  Pneumocytes   which  results  in  low  production  of  Surfactants   hence  results  in  increases  in  alveolar  surface  tension  and  finally  leads  to  Alveolar  Collapse  which  is  marked  by  decrease  in  gas  exchange  causing  decrease  in  blood  oxygen  level  known  as  Hypoxemia.  At  the  same  time  increased  level  of  inflammatory  cytokines  such  as  TNF - alpha  attracts  Neutrophils  at  the  site  of  inflammation  which  than  releases  Reactive  Oxygen  Species ( ROS )  and  Protease  which  initiate  viral  sepsis  and  inflammatory  induced  lung  damage.  Out  of  so  many  cytokines ,  cytokines  IL - 1  and  IL - 6  travels  to  Hypothalamus  in  brain  and  stimulate  it  to  release  certain  Prostaglandins  which  will  increase  the  body  temperature  and  result  in  Fever.

  

REASON FOR DEATH OF COVID PATIENTS :

Decrease  oxygen  level  in  blood  will  further  stimulate  chemoreceptors  which  in  turn  stimulate  Sympathetic  system  finally  results  in  increase  Heart  rate  and  Respiratory  rate.  Uncontrolled   release  of  high  level  of  inflammatory  cytokines  in  Severe  patients  leads  to  Systemic  Inflammatory  Response  Syndrome ( SIRS )   which  occurs  due  to  decrease  blood  volume  and  increase  Peripheral  resistance  leads  to  Hypotenshion  which  in  turn  decrease  Organ  profusion  and  result  in  multiple  organ  damage  finally  leads  to  the  death  of  the  covid  patients.